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m6A研究技术及思路系列|m6A研究技术比较

导读

关于m6A系列,上期文章给大家简单介绍下m6A的基本知识,本期再给大家分享m6A研究技术的比较


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m6A主要检测技术有哪些?

m6A检测技术主要包括两种角度,一种是从整体上检测m6A水平,另一种是通过高通量测序的方法大规模检测m6A。其中LC-MS/MS和比色法能够检测RNA整体的m6A水平,但无法满足大规模的基因检测以及整个转录组水平分布的m6A研究要求,更不能确切的定位甲基化位点。meRIP-seq(即我们常说的m6A-seq)和miCLIP-seq属于高通量测序手段,其中miCLIP-seq可以精确到单碱基甲基化分辨率,但实验难度大,实验成本高。

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LC-MS/MS检测

LC-MS/MS的原理是根据m6A和总腺嘌呤的比例算出样品RNA上整体的m6A甲基化程度。具体实验步骤如下:


Step1. 第一步使用TRIzol提取完Total RNA后,可以用oligo dT磁珠对mRNA进行富集,也可以使用rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA;

Step2. 第二步使用核酸酶P1(Nuclease P1)将RNA从单链消化成单个核苷酸;

Step3. 第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时,核苷酸消化成核苷,将样本注射入液相色谱仪,根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量;

Step4. 第四步进入质谱串联分析,单个核糖核苷会被离子化,同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤,最后根据出峰的保留时间计算m6A的面积;


最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。即:样品整体m6A水平=质谱检测m6A含量/液相色谱检测总A含量。

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比色法

比色法的原理是根据附着在m6A的荧光强度推算m6A在mRNA中的比例。该方法与LC-MS/MS比较相似,也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作,比色法更为简便,很多实验室都有条件和能力完成。


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miCLIP-seq

miCLIP-seq的原理是利用m6A抗体富集m6A修饰,配合紫外交联技术,在全基因组范围鉴定单碱基水平的m6A修饰。实验步骤如下:



Step1. 对富集完的RNA(oligo dT磁珠或rRNA去除试剂盒)进行片段化;

Step2. 使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的RNA片段进行结合;

Step3. 在紫外线交联之后,抗体-RNA复合物共价结合,用proteinA/G亲和提取回收,SDS-PAGE和硝化纤维膜印迹;

Step4. 用蛋白酶K将RNA从膜上释放,进行反转录,在RNA逆转录为cDNA时遗留在RNA上的肽段会阻止转录或特异性突变,导致核苷酸整合错误(表示为C→T转化)和cDNA截断;

Step5. 然后构建测序文库上机测序。

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meRIP-seq


meRIP-seq又被称为m6A-seq,原理是利用m6A抗体富集含有m6A的RNA片段,然后对富集的片段进行测序。实验步骤如下:

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由于meRIP-seq以相对合理的成本和价格能够对样品进行全基因组范围内的m6A检测,并且m6A可被定位在~100nt的转录本区域范围,因此被广泛的应用在m6A研究中。


最后总结下这4种技术的比较,大家可以根据自己的需求和条件选择合适的技术来满足研究目的。

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预告:m6A研究技术及思路系列下一篇将给大家分享使用meRIP-seq技术进行m6A研究的思路和案例,大家可以继续关注。

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