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m6A研究技术及思路系列|m6A研究思路

相信大家看过前两期文章后对于m6A的基础知识和研究技术有一定了解了,那本期继续给大家分享m6A的研究思路。

m6A文章研究方向

m6A文章常见研究方向主要包括以下三种,三个研究方向从宏观到具体、从粗到细、层层递进的过程。


1. 通过m6A-seq,宏观研究m6A修饰的分布和差异与表型的潜在关系。

2. 研究某个或某些参与m6A修饰的酶,该酶可能影响多个相关peak的形成,关注酶在m6A修饰过程起到的作用以及对下游的基因表达和生物学功能的影响。

3. 研究m6A修饰的基因,关注m6A修饰对基因表达的调控机制。

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从实验设计的深度来看,也是由浅入深,并且与发表文章的影响因子有一定的联系。

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生物学功能验证技术

m6A文章主要应用的湿实验验证方向和技术如下。

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案例

这篇文章我们先只分享第一种思路方向,从全局出发研究m6A甲基化修饰。


该思路主要针对此前没有或者极少RNA甲基化相关报道的物种,先从宏观的测序角度,寻找时期、部位、不同性状间的m6A修饰差异。使用meRIP-seq或加转录组测序,对测序结果的图形和表格,进行有逻辑的罗列展示,以得到初筛的目标结果和框架性研究结果。

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样品设计:收集萌发五周后的拟南芥的花、叶、根做meRIP-seq,每种器官2个生物学重复。

分析步骤如下:

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首先从宏观上看三种器官整体的甲基化情况。

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3种器官m6A修饰的mRNA分布。三种器官m6A修饰富集于3’UTR区,说明m6A甲基化的位置在器官间具有相似性。

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3种器官间m6A修饰以及mRNA差异统计。通过统计不同器官间m6A修饰与转录本差异数量,表明mRNA的m6A修饰是一种相对独立事件。

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3种器官m6A修饰的mRNA位点统计。在叶、花、根中超过80%m6A修饰的mRNA重叠,说明m6A在器官间的表达具有相似性。

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拟南芥m6A的motif分析。超过17%的m6A修饰的mRNA为>4个甲基化位点,和已报道的人类m6A模式(5.5%)存在差异性,说明不同物种间的m6A修饰存在差异。超过75%的m6A修饰为RRm6ACH模式,与其他物种所报道的相同,说明m6A修饰模式具有保守性。


然后再进行不同器官之间peak比较分析。


共有peak分析: 290个(5.1%)共有peak关联的mRNA主要富集在核内、转运蛋白、防御或应激反应、核酸结合、转录调控等有关功能




特有peak分析:花中甲基化基因与RNA降解、DNA复制和蛋白质合成代谢的代谢途径等相关。根中呈现更高甲基化的基因涉及生物碱的生物合成和碳酸盐代谢。叶广泛甲基化基因主要与光合作用、转录的调节、昼夜节律等相关。


该文章从整体上对测序结果进行挖掘和整理,从宏观上结合试验设计来说生物学故事(不同物种之间宏观比较,不同器官之间比较)。该文章思路较简单,也无更多湿实验。

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